Contribution à l’étude de la régulation du métabolisme carboné de l’ectomycorhize d’Eucalyptus globulus - Pisolithus tinctorius. Caractérisation, clonage et expression de l’isocitrate déshydrogénsase à NADP de la racine.
Vincent BOIFFIN
Thèse soutenue le 18 Décembre 1997, Université Paris XI Orsay
Travail réalisé à l’Equipe de Microbiologie Forestière, INRA-Nancy, sous la direction de Francis Martin
L'association ectomycorhizienne est une symbiose mutualiste entre les racines des arbres des écosystèmes tempérés, montagnards et boréaux. La croissance et le développement des ligneux dépendent de cette interaction, grâce aux échanges nutritionnels s'effectuant au sein de cet organe symbiotique. Des acides aminés synthétisés par le champignon associé sont échangés avec l'arbre-hôte contre des sucres issus de la photosynthèse. De cette manière, la nutrition azotée de l’hôte est conséquemment améliorée, de même quant au partenaire fongique pour sa nutrition carbonée. Ceci conduit à des modifications des relations source-puits de la racine. En particulier, le flux de carbone servant à alimenter le partenaire fongique est augmenté. Grâce à des ectomycorhizes d'Eucalyptus globulus-Pisolithus tinctorius obtenues in vitro, l'impact de la mycorhization sur les voies métaboliques contrôlant l'interaction carbone/azote a été étudié en comparant la racine mycorhizée à la racine non-inoculée.
L'analyse RMN de l'assimilation du [1-13C]glucose dans l'ectomycorhize montre que les teneurs en composés carbonés (acides aminés et sucres) de la racine et du mycélium sont modifiées par rapport aux partenaires non-associés. La glutamine (Gln) est l'acide aminé le plus marqué : 17% du marquage dans la racine, 30% dans l'ectomycorhize et 43% dans le mycélium seul. L'alanine est aussi fortement marqué dans l'ectomycorhize et dans le mycélium. Le flux de carbone (via le cycle de Krebs) approvisionne de manière conséquente la synthèse de Gln. Le marquage intramoléculaire de la Gln fait ressortir l'importance de la fixation anaplérotique du CO2. D‘autre part, des polyols fongiques (arabitol et érythritol) ont leur concentration augmentée cinq fois lorsque le partenaire fongique est associé à la racine. Cet accroissement permettrait une augmentation de la pression de turgescence qui serait nécessaire à l’invasion entre les cellules de l‘hôte par les hyphes fongiques. Ces études de marquage isotopique révèlent l'intérêt de l'étude des enzymes à l'interconnexion entre les métabolismes de l'azote et du carbone et leur co-régulation dans l'ectomycorhize, en particulier, la biosynthèse de Gln dans la racine mycorhizée ou non.
La biosynthèse des acides aminés est consommatrice d'acides organiques issus du cycle de Krebs. Une stimulation de la synthèse d'acides aminés provoque une augmentation de la respiration et de la production de CO2. La phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC) est impliquée dans le recyclage du CO2 appelé : fixation anaplérotique du CO2. Cet enzyme est stimulé quatre fois dans l'ectomycorhize sans augmentation de la concentration du polypeptide, ni du niveau de phosphorylation de l’enzyme. La stimulation de la PEPC suggère une augmentation de la fourniture en acides organiques comme l’a-cétoglutarate nécessaire à la biosynthèse de Gln. Cela corrobore les résultats obtenus avec l’analyse RMN de l’assimilation du 13C glucose.
L’isocitrate déshydrogénase à NADP (CDH à NADP) cytosolique fournit l’a-cétoglutarate utilisé pour l’assimilation de l’azote (production de Gln). L’activité de l’enzyme est stimulée deux fois dans l’ectomycorhize, mais sa localisation tissulaire prépondérante dans les tissus conducteurs et dans l'épiderme n'est pas modifiée. Afin d'étudier les mécanismes moléculaires impliquées dans la biosynthèse de l'ICDH à NADP, un ADNc pleine longueur (EgIcdh) a été cloné à partir d'une banque d'ADNc d'ectomycorhize d'E. globulus-P. tinctorius obtenues in vitro, EgIcdh possède les caractéristiques de séquence d'ICDH à NADP de plante et ne possède pas de peptide signal putatif. EgIcdh code pour l'ICDH à NADP cytosolique d'E. globulus. L'extrémité 3' de l'ADNc a servi de sonde moléculaire pour étudier l'expression du gène EgIcdh au cours de la formation de l'ectomycorhize. L'accumulation des transcrits EgIcdh est augmentée deux fois dans les ectomycorhizes âgées de 2 et 4 jours. La stimulation de l'activité enzymatique apparaît liée à l'augmentation de la concentration en transcrits EgIcdh.
La glutamine synthétase (GS) est l'enzyme-clef de l'assimilation de l'ammonium et produit la Gln. Avec un fragment d'ADNc codant pour une sous-unité de la GS cytosolique (EgGs), le niveau de transcrits EgGs a été suivi au cours de la formation de l'ectomycorhize. L'expression du gène EgGs est réprimée dans les ectomycorhizes âgées de 2 jours. A des stades plus tardifs, elle revient à un niveau comparable de celui de la racine non-inoculée. L'absence de stimulation de la GS de l'hôte suggère que la Gln est directement fournie par le partenaire fongique.
Les changements de concentrations des pools de métabolites (acides aminés et sucres) dans la racine mycorhizée pourrait intervenir dans la stimulation de la PEPC et l'ICDH à NADP, mais pas la GS. La Gln fortement accumulée dans la mycorhize doit vraisemblablement être synthétisée par le mycosymbiote. Elle devrait être alors transférée dans la racine-hôte. Ce pool de Gln importé devrait être transformée en glutamate grâce à la glutamate synthase qui utilise l'acétoglutarate. Cette redistribution en acides aminés impliquerait une augmentation de la production en acides organiques, et donc la stimulation de la PEPC et l'ICDH à NADP. La forte accumulation de Gln n’activerait pas la GS. La formation de l’ectomycorhize E. globulus-P. tinctorius stimule donc des enzymes de l'interaction carbone/azote directement connecté à l'assimilation de l'azote dans la racine.